酶聯(lián)免疫吸附測定類型與操作步驟

　　雙抗體夾心法檢測抗原

　　雙抗體夾心法是檢測抗原常用的方法，但要注意的是在一步法(待測抗原與酶標抗體一起加入反應)測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結(jié)合，而不再形成“夾心復合物"出現(xiàn)鉤狀效應，甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質(zhì)(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)時，應注意可測范圍的高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。 雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子(RF)的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽性反應。雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。

　　雙抗體夾心法的簡要操作步驟為：

　　1)先加入抗體，使抗體固定結(jié)合于載體表面;

　　2)再加樣品，使目標檢測抗原形成抗原-抗體復合物;

　　3)加酶標抗抗體(第二種動物抗抗原的酶標抗體);

　　4)加入酶促反應底物，發(fā)生顯色反應，顯色的深淺與待測抗原的量成正比。

　　競爭法檢測抗原

　　當小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的抗體結(jié)合位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。方法的基本原理可見圖2，經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標記抗原和被測抗原的混合液，而另一組只加酶標記抗原，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為所要測定的未知抗原的量。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

　　競爭法的簡要操作步驟：

　　1)先加入抗體，使抗體固定結(jié)合于載體表面;

　　2)加入梯度濃度比例的待測樣品與酶標抗原混合物,同時做只加酶標抗原的對照組;

　　3)加入酶促反應底物，發(fā)生顯色反應，對比實驗組及對照組的顯色差異，計算未知抗原的量。

　　雙抗原夾心法檢測抗體

　　雙抗原夾心法的反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標抗原的制備，應根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標記方法。

　　雙抗原夾心法的簡要操作步驟為：

　　1)先加入抗原，使抗體固定結(jié)合于載體表面;

　　2)再加樣品，使目標檢測抗體形成抗原-抗體復合物;

　　3)加酶標抗原;

　　4)加入酶促反應底物，發(fā)生顯色反應，顯色的深淺與待測抗體的量成正比。

　　間接法檢測抗體

　　間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體(辣根過氧化物酶標記的兔抗人免疫球蛋白抗體)以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體(人免疫球蛋白)，故稱為間接法。本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。

　　間接法的簡要操作步驟：

　　1)將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原;

　　2)加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗-體復合物;

　　3)加酶標抗抗體;

　　4)加入酶促反應底物，發(fā)生顯色反應，顯色的深淺與待測抗體的量成正比。

　　競爭法檢測抗體

　　競爭法測抗體的反應模式與競爭法測抗原類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應的抗體。當抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺于陰性反應。如抗原為高純度的，可直接包被固相。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結(jié)合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結(jié)合，洗滌后再加入酶標抗體，與結(jié)合在固相上的抗原反應?？笻Be的檢測一般采用此法。

　　競爭法的簡要操作步驟：

　　1)先加入特異性抗原，使抗原固定結(jié)合于載體表面;

　　2)加入梯度濃度比例的待測樣品與酶標抗體混合物，并做只加酶標抗體的對照組;

　　3)加入酶促反應底物，發(fā)生顯色反應，對比實驗組及對照組的顯色差異，計算未知抗體的量。

　　捕獲包被法檢測抗體

　　捕獲包被法(亦稱反向間接法)ELISA，主要用于血清中某種抗體亞型成分(如IgM)的測定。以目常用的IgM測定為例，因血清中針對某種抗原的特異性IgM和IgG同時存在，則后者可干擾IgM的測定。因此先將所有血清IgM(包括異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上，在去除IgG后再測定特異性IgM。IgM抗體的檢測用于傳染病的早期診斷中。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM(其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM)。然后加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結(jié)合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標本中的IgM成正相關(guān)。此法常用于病毒性感染的早期診斷。類風濕因子(RF)同樣能干擾捕獲包被法測定IgM抗體，導致假陽性反應。因此中和IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。

　　捕獲法測抗體的簡要操作步驟：

　　1)特異性捕獲抗體的包被，先把能特異性結(jié)合待測抗原的抗體固定于固相載體表面;

　　2)加入待測樣品，通過固定在載體表面的針對該抗原的抗體固定于載體表面;

　　3)加入特異性抗原以及針對該特異性抗原的酶標抗體;

　　4)加入酶促反應底物，發(fā)生顯色反應，顯色的深淺與待測抗體的量成正比。

　　ABS-ELISA法

　　除以上6種ELISA測試方法外，近年在親和素-生物素系統(tǒng)上又發(fā)展出ABS-ELISA法 。親和素是一種糖蛋白，每個分子由4個能和生物素結(jié)合的亞基組成，生物素為小分子化合物。用化學方法制成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯可與抗體或酶形成生物素標記產(chǎn)物，標記方法頗為簡便，并且不影響抗體或酶原有的生物學活性。親和素生物素系統(tǒng)，簡稱ABS(avidin-biotin system)。由于親和素與生物素間的親和力強，結(jié)合迅速，且其穩(wěn)定，使BAS標記技術(shù)比常規(guī)酶聯(lián)免疫、放射免疫及熒光免疫技術(shù)有著更高的靈敏度，為微量抗原、抗體的檢測開辟了新的途徑，大大提高了檢測的靈敏度，但該方法比普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，因此在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多。ABS-ELISA法可分為酶標記親和素-生物素(LAB)法和橋聯(lián)親和素-生物素(ABC)法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體(或抗原)代替原ELISA系統(tǒng)中的酶標抗體(抗原)。

　　在LAB法中，將特異性抗體生物素化、酶分子標記在親和素分子上，生物素化抗體與被檢抗原結(jié)合后，再借BAS的高度親和力將酶分子聯(lián)結(jié)到抗原分子上，經(jīng)酶促反應即可檢出抗原，因此提高檢測的敏感度。

　　ABC法同樣將特異性抗體生物素化、酶分子標在生物素上，親和素和酶標生物素需要先按一定比例形成ABC復合物，這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)結(jié)合了大量的酶分子，當親和素尚未被酶標生物素飽和時，生物素化抗體即可與之結(jié)合, 使被檢抗原、生物素化抗體和酶標生物素聯(lián)成一體。

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